运用GC-MS非靶向代谢组学研究霍山石斛对纳米的生理代谢响应机理

前言

霍山石斛是一种多年生附生草本植物，是一种名贵中草药，具有多种药理作用。野生霍山石斛生长在岩石上，根据调查发现霍山石斛在磁铁矿岩石上生长得比普通岩石更好，现有研究表明Fe强烈影响其原球茎样体的增殖和多糖生物合成。虽然地壳中的铁元素充足，但多以不溶性的化合物存在，这导致自然界中的植物不容易吸收利用铁元素。而纳米颗粒(NPs)粒径微小，可以作为生物活性分子的纳米载体。因此，研究如何将纳米FeO作为纳米肥料应用于霍山石斛的生长具有重要意义。

(资料图片)

本研究采用ICP-MS测定金属元素的含量，应用GC-MS非靶向代谢组学方法检测FeO纳米颗粒的代谢产物的含量和组成。为霍山石斛药材的质量改进提供了有价值的信息。

2022年8月，安徽中医药大学刑世海教授团队在Frontiers in Nutrition发表了题为“ICP-MS based metallomics and GC-MS based metabolomics reveals the physiological and metabolic responses of Dendrobium huoshanense plants exposed to FeO nanoparticles”(IF=6.590)的研究文章。该文章作者通过ICP-MS和GC-MS非靶向代谢组学结合植物生理参数分析等研究方法，发现霍山石斛对FeO纳米颗粒有一定的代谢物重编程反应，进而改变了霍山石斛细胞的脂膜以更好地应对胁迫。描绘了FeO纳米粒子在霍山石斛上具有潜在的纳米肥料应用前景，为将一些不易被植物吸收的营养物质转化为纳米材料以提高其利用率提供了理论依据。

中文标题：基于ICP-MS的金属组学和基于GC-MS的代谢组学研究霍山石斛对纳米FeO的生理代谢响应

研究对象：霍山石斛

发表期刊：Frontiers in Nutrition

影响因子：6.590

发表时间：2022年8月

发表单位：安徽中医药大学

运用生物技术：ICP-MS金属组学、GC-MS非靶向代谢组学（由鹿明生物提供技术支持）

研究思路

研究方法

1.实验材料

将霍山石斛移栽到水培系统中，其他条件保持相同，在纳米水中制备100 mg/L和200 mg/L的纳米FeO纳米颗粒原液，将FeO纳米颗粒溶解在营养液中，在45 kHz的频率下在冰浴中超声处理60min，作为处理组，以不含纳米颗粒的相同溶液为对照。所有幼苗在温室中培养21天，每3天更换一次营养液，直到收获。

2.表型分析

分别于处理后0、7、14、21d对霍山石斛的生长进行了宏观观察。

3.生理参数分析

生物量和光合作用参数测定：测量新鲜生物量,对幼苗的光合色素含量进行了测定。

丙二醛和酶粗提物：相关抗氧化酶，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的酶活性测量和丙二醛含量的测量。

铁和其他矿物质营养素：ICP-MS测量测定铁和其他微量营养素(铜、锰、锌、钴、硼、钼、碘)的含量。

霍山石斛中的生物活性成分：高效液相色谱仪总生物碱在620nm处的吸光度测量；黄酮类成分在510nm处的吸光度进行定量的含量。通过HPLC测定霍山石斛单糖含量。

4.多组学分析

GC-MS代谢组学分析：每组10个重复

ICP-MS金属组学分析。

研究结果

1. FeO纳米颗粒处理后霍山石斛的生化反应

丙二醛含量的测定结果说明200 mg/L的FeO纳米颗粒对霍山石斛的氧化胁迫作用较早，而100 mg/L的FeO纳米颗粒诱导的氧化胁迫作用明显较晚（图1A）。SOD活性的变化大致反映了丙二醛含量的变化(图1B)。有意思的是，从第7天到第14天，处理组的过氧化物酶活性低于对照组(图1C)。这可能归因于FeO纳米粒子具有内在的类似过氧化物酶的活性。此外，FeO纳米颗粒处理组的过氧化氢酶水平与对照组相似(图1D)。

图1 | Fe3O4纳米颗粒处理后霍山石斛的生化反应

2. FeO纳米颗粒处理后霍山石斛中的主要生物活性成分

测定霍山石斛茎中多糖和单糖的总含量(图2)以了解FeO纳米颗粒对霍山石斛固碳的影响。霍山石斛多糖含量在第7天达到峰值，而对照组多糖含量略有增加。甘露糖的变化趋势与多糖的变化趋势基本一致。有趣的是，从第7天到第21天，200 mg/L FeO纳米颗粒组的多糖和甘露糖含量都下降了31.98%(表1)。推测这一变化是由于霍山石斛开花早，导致甘露糖消耗过多，从而影响了总多糖的含量。100 mg/L和200 mg/L的纳米FeO对霍山石斛的葡萄糖含量有明显的促进作用，7d后葡萄糖含量基本稳定。

图2 | Fe3O4纳米颗粒处理后霍山石斛中的主要生物活性成分

表1 | Fe3O4纳米颗粒处理后霍山石斛中的主要生物活性成分

3. FeO纳米颗粒处理后铁和其他矿物质的变化

在培养第21 d时，用电子显微镜观察霍山石斛根、茎、叶细胞的变化(图3)。结果表明，随着FeO纳米粒子处理浓度的增加，根细胞颜色变暗，这可能是由于FeO纳米粒子在根皮层细胞附近的吸附所致。霍山石斛的茎薄壁细胞在FeO纳米颗粒浓度梯度上也有不同程度的变小增厚。电感耦合等离子体质谱结果显示，100 mg/L和200 mg/LFeO纳米粒子处理的霍山石斛茎中的Mn、Co、B、Mo和I含量显著高于对照(表2)，这可能是由于它们的营养元素互补作用所致。相比之下，铜和锌的含量没有变化。

图3 | Fe3O4纳米颗粒处理后霍山石斛根、茎、叶细胞的变化

表2 | Fe3O4纳米颗粒处理后铁和其他矿物质

4.FeO纳米颗粒处理后三羧酸循环与碳水化合物(碳代谢)的变化

琥珀酸是三羧酸（TCA）循环的主要中间体，在接触FeO纳米颗粒后，琥珀酸的含量显著减少。另一种三羧酸循环中间体马来酸在接触FeO纳米粒子后也减少了（图2-5）。三羧酸循环是细胞呼吸机制的核心，三羧酸循环中间产物的下调可能表明霍山石斛呼吸作用受到抑制。结合前面的霍山石斛生理生化指标分析，FeO纳米颗粒处理提高了霍山石斛的叶绿素含量。所以FeO纳米颗粒可能会减少植物的呼吸，增强光合作用，减少有机质的消耗，增加有机质的积累，从而促进植物的生长。

图4 | FeO纳米颗粒处理后三元酸循环与碳水化合物(碳代谢)

5.FeO纳米颗粒处理后抗氧化剂，脂肪酸的变化

通过GC-MS非靶向代谢组学分析，与对照组相比，Fe3O4纳米粒子处理组绿原酸含量显著降低，4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸、3，4-二羟基肉桂酸、水杨酸、对苯二酚、去甲肾上腺素、1，2，3-三羟基苯、1，2，4-苯三酚等具有清除ROS能力的代谢物减少了16-49%(图5)。Fe3O4纳米颗粒的POD模拟活性清除了处理植株中的一些ROS，从而保护了霍山石斛的内源非酶抗氧化系统。FeO纳米颗粒可能调节霍山石斛的抗氧化防御途径。

在本研究中，接触FeO纳米颗粒(图6)的霍山石斛体内十五烷酸和榄香酸的含量均显著增加，这可能是该植物对环境变化的一种适应。另一个显著上调的是3-羟甲基戊二酸；相比之下，L-2-羟基戊二酸和几种不饱和脂肪酸(衣康酸、反式肉豆蔻酸和亚麻酸)的表达显著下调。显然，观察到的脂肪酸变化的一个潜在原因是脂质过氧化。这也可能是因为霍山石斛调节根部细胞膜的流动性，限制多余的铁离子渗透到其细胞中，从而防止过量的铁损害植物。

图5 | Fe3O4纳米颗粒处理后抗氧化剂的变化

图6 | Fe3O4纳米颗粒处理后脂肪酸的变化

研究结论

本研究发现100 mg/L和200 mg/L的纳米FeO对霍山石斛没有明显的毒性作用。相反，增加了霍山石斛叶片中的叶绿素含量增加。此外，主要生物活性物质(多糖)的含量也有不同程度的增加，尤其是增加了霍山石斛对铁和其他微量元素(Mn、Co、B、Mo)的吸收和积累；且霍山石斛对FeO纳米颗粒有一定的代谢物重编程反应，得益于纳米颗粒的抗氧化酶活性，它取代了霍山石竹天然小分子抗氧化剂的部分功能，大多数酚类代谢物和脂肪酸的减少暗示了FeO纳米颗粒改变了霍山石斛细胞的脂膜，而不需要积累酚类物质来增强其抗氧化防御系统，以更好地应对胁迫。

此外，FeO纳米粒子还干扰了氨基酸代谢途径，这表明它们可以改变氮代谢的动态和能量的重新分配。这些结果表明，FeO纳米粒子在霍山石斛上具有潜在的纳米肥料应用前景，为将一些不易被植物吸收的营养物质转化为纳米材料以提高其利用率提供了参考。

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霍山石斛是一种珍贵的具有多种药理作用的名贵药材。本文使用ICP-MS金属组学、GC-MS非靶向代谢组学研究霍山石斛对纳米Fe3O4的生理代谢响应。其严谨的实验思路和深入地研究结果，值得借鉴和参考，为霍山石斛药材的质量改进提供了有价值的信息。

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