快播：【评测】Nucleofector电转技术在基因编辑方向的应用

基因表达调控的方式有很多种，但不外乎在DNA水平、RNA或蛋白质水平进行调控。多数的方式仅能对基因进行高效的、瞬时的调控，这在某些应用场景下非常有优势。也可以通过质粒、转座子、病毒的随机整合或同源重组完成稳定的和可遗传的DNA修饰。但是，要实现位点特异性的整合是非常耗时且困难的。随着先进的基因组编辑工具不断被发现，位点特异性稳定修饰变得更容易实现。北京泽平科技Nucleofector核转仪等相关技术产品，请搜索“北京泽平科技 ”进入咨询。

在过去的十年中，锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）技术被确立为位点特异性基因组修饰的有用工具，但随着最近规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）技术的出现，它成为了另一种有效的替代方案。

(相关资料图)

通过基因组编辑靶向修饰细胞DNA为基础生物学研究、早期药物发现和新型细胞疗法（例如免疫疗法）的开发提供了强有力的工具。

CRISPR技术利用工程化核酸酶在靶基因组位置删除、插入或替换基因（Gaj et al., 2013）。Cas9核酸酶在基因组DNA中产生双链断裂，从而诱导两种可能的细胞修复过程：1.非同源末端连接（NHEJ）可导致功能基因的缺失，因为它在关闭断裂时通常伴随突变。2.如果可获得部分同源供体序列，则可通过同源依赖性修复（HDR）进行基因的插入或替换。为了在特定靶序列上进行这种修饰，核酸酶与序列特异性DNA结合，将核酸酶导向靶序列。

基因组编辑工具

如上所述，对于基因组编辑，工程化核酸酶用于在靶基因组特定位置删除，插入或替换基因。这种工程化核酸酶通常由两个元件组成：内切核酸酶DNA切割模块和序列特异性DNA结合结构域。核酸酶切割双链DNA，产生双链断裂（DSB）。DSB诱导细胞DNA修复过程。这可能会发生两种类型的修复过程，1.如果没有可用的同源供体片段-无论是相应的等位基因还是外部供体DNA-断裂的末端将被重新连接。该过程称为非同源末端连接（NHEJ），并且通常可能导致基因功能元件缺失的突变。

如果存在同源的序列，例如基因组等位基因或外源供体DNA，则可以通过同源重组修复（HDR）进行基因的插入或替换。NHEJ与HDR的频率取决于实验设置，例如细胞类型和供体量。

这些核酸酶与序列特异性DNA结合结构域的组合可以定制以识别几乎任何序列，以位点特异性的方式进行基因组编辑。

常用的位点特异性的基因组编辑工具有以下三种：

· ZFN

· TALEN

· CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9

CRISPR技术来源于细菌防御病毒入侵的途径，目前已经广泛地应用于真核生物的基因组编辑。相较于ZFN和TALEN，它更具有灵活性。

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与ZFN和TALEN相比（详见下文），基于CRISPR的基因组编辑依赖于两个独立的组件一起工作：

CRISPR-Cas9

DNA靶向部分: 所谓的靶向RNA（gRNA），通常与18-21bp的基因组DNA片段互补。

Cas9核酸酶：一旦gRNA与基因组DNA链配对，Cas9核酸酶就会切割基因组DNA，引起双链断裂。

由于DNA特异性部分是RNA分子，因此比ZF-或TALE-核酸酶融合蛋白更容易设计和生产。此外，通过将Cas9核酸酶与靶向不同位点的几种gRNA一起转移，可以进行多基因组编辑。

基于CRISPR-Cas9的细胞共转染方案

· 转入一个同时包含gRNA和Cas9核酸酶的质粒

· 共转入两个单独的质粒（一个含有gRNA，另一个包含Cas9）

· 共转一个包含Cas9的质粒和一个可以表达gRNA的PCR序列

· 体外组合的Cas9-gRNA的RNP复合物

· 如果是为了插入或替换，还需要再共转一个供体DNA质粒或一个单链核苷酸（ssODN）

Lonza独有的NucleofectorTM高级电转技术已被证明可作为基于CRISPR的基因组编辑工具的可靠转染方法

NucleofectorTM高级电转技术特点

1.广泛的细胞类型（包括iPSC）具有高转染效率

2.有效地共转染各种底物

3.使用简单，转染质粒、DNA、mRNA、PCR序列或ssODN时可采用相同的实验条件

(Ran et al., 2013) Nature Protocols出版物提供了关于使用4D NucleofectorTM系统进行CRISPR转染的非常全面的指南。

ZFN

锌指（ZF）蛋白是自然界中最丰富和最通用的DNA结合结构域(Tupler R et al., 2001)。单个锌指结构域结合3个DNA碱基对。由于它们的模块化结构，它们为设计人工序列特异性结合分子提供了理想的框架。ZF与内切核酸酶（主要是Fok1）的融合构建了锌指核酸酶（ZFN）。两种这样的ZFN组合起作用以结合靶DNA序列的有义和反义链。结合后，Fok1核酸酶形成活性二聚体并诱导双链断裂，引起随后的细胞修复过程。

Lonza的NucleofectorTM高级电转技术已经被成功的应用于ZFN的转染。更多信息，请点击阅读原文，申请Technical Reference Guide。

TALEN

2009年，科学家们发现转录激活因子样效应子（TALEs）可作为更简单的模块化DNA识别蛋白(Boch et al., 2009; Moscou et al., 2009)。TALE是来自植物病原菌属Xanthomonas天然存在的蛋白质，并且含有DNA结合重复序列，每个重复序列识别单个碱基对。与锌指的基于三联体的DNA结合相比，TALE-DNA结合重复的这种单碱基识别模式使得设计具有更大的灵活性，但也存在一些克隆挑战。同样，工程化的TALE通常与Fok1核酸酶融合以构建TALE核酸酶融合物（TALEN）。与ZFN一样，必须为每个靶标产生一对TALEN，每个单体结合(Jinek et al., 2013) 靶DNA的有义或反义链。

Lonza的NucleofectorTM高级电转技术已经被成功的应用于TALEN的转染。更多信息，请点击阅读原文，申请Technical Reference Guide。

引用文献

1.Gaj T et al. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology 31(7):397-405 (review)

2.Petit CS et al. (2013) J Cell Biol 202:1107-1122 (cells: HeLa)

3.Ran FA et al. (2013) Cell 154:1380–1389 (cells: various cell lines, e.g. HEK293FT)

4.Ran FA et al. (2013) Nat Prot 8(11):2281–2308 (cells: HEK293 and HUES62)

5.Seki and Rutz. (2018) J Exp Med 215(3):985-997

6.Tupler R et al. (2001) Nature 409: 832-833

7.Boch J et al. (2009) Science 326 (5959): 1509–12

8.Jinek M et al. (2013) eLife 2: e00471

9.Moscou MJ et al. (2009) Science 326 (5959): 1501

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