播报：单细胞测序揭示慢性皮肤粘膜念珠菌病免疫细胞群和基因表达的改变

前言

(相关资料图)

2022年9月15日，一篇题为“Single-cell RNA sequencing combined with whole exome sequencing reveals the landscape of the immune pathogenic response to chronic mucocutaneous candidiasis with STAT1 GOF mutation”关于对CMC患者PBMC样本的单细胞以及全外显子测序的文章，发表于《Frontiers in Immunology》（IF：8.786）期刊。作者发现了该名CMC患者具有STAT1 GOF (c.Y289C) 突变以及免疫细胞群的改变，确立了单细胞RNA-Seq技术作为研究CMC免疫致病反应策略的可行性，有助于对该突变引起的CMC的临床特征有更深入的了解。

基本信息

期刊：Frontiers in Immunology

影响因子：8.786

材料：健康人和CMC患者的PBMC样本

方法：10×Genomics scRNA-seq、Whole exome sequencing

研究结果

Result 1 患者的临床信息

患者为临床诊断为慢性皮肤粘膜念珠菌病（CMC）的12岁男孩(图1A，B，C，D)，由于患者的父母都正常，且在家族史中没有类似的病例，因此推测患者是新生突变或者隐性纯和，于是采取了患者及其父母的外周血进行了全外显子测序（WES）。WES结果表明患者体内的STAT1基因发生杂合突变，导致酪氨酸被半胱氨酸取代(c.866 A>G；p.Y289C)，而他的父母都没有携带该突变(图1E)。通过Sanger测序验证了WES测序数据，并确定了该突变的位置(图1F)。

图1 | 一例CMC患者的临床特征、实验室检查和基因检测

Result 2单细胞转录学揭示了CMC免疫细胞群的改变

在患者以及健康对照的PBMC样本中，分别捕获了11430和10191个单细胞，经过Seurat质控后，分别从患者和健康对照中获得了7393个和9186个单细胞的转录本。进一步降维聚类后将所有细胞分成了10个cluster(图2)，根据已知标记基因的表达，确定了单核细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞的细胞谱系(图3A-D)。与健康对照组相比，患者外周血单核细胞减少，NK细胞增加。然后作者对T细胞和B细胞做进一步的亚群分析 (图3E，F)，结果发现与对照者相比，该患者的PBMC样本中Naive B占比较多，而immature B相对较少。

图2 | 单细胞RNA-seq研究设计和降维聚类结果图

图3 | 细胞类型鉴定

为了进一步探索患者和健康对照组PBMC中差异表达基因，作者做了差异以及富集分析(图4B-E)。富集分析表明，患者下调的差异基因多富集到多肽抗原与MHC-II类蛋白复合体的组装，中性粒细胞的脱颗粒，免疫反应，溶酶体等条目；而上调的差异基因在细胞质翻译，多聚核糖体，核糖体的结构组成等条目中富集。接下来，作者进一步比较CMC患者和健康对照组的差异基因来发现与CMC相关的免疫分子特征(图4A和图5)。与对照组相比，患者外周血中RGS1以及TNFAIP3的表达明显上调。RGS1在调节淋巴细胞和单核/巨噬细胞的定位方面发挥重要作用，也可以通过趋化因子信号调节B细胞归巢到淋巴结。TNFAIP3不仅通过NF-kB途径抑制炎症，而且还抑制STAT1和IFN-γ途径。

此外，TNFAIP3对Th17细胞分泌IL-17起负调节作用，CMC通常表现为严重的T细胞免疫缺陷，主要与Th17细胞通路受损有关，因此TNFAIP3可能是CMC的一个潜在致病机制。与健康对照组相比，CMC患者CTSS的表达显著下调。CTSS主要表达在B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞中，并调节抗原的处理和提呈以及T细胞介导的免疫反应，CTSS表达降低会影响蛋白水解酶活性及相关的酶免疫反应。

图4 | 差异表达基因的筛选和功能分析

图5 | 蛋白质相互作用网络图

文章总结

本文作者在一名CMC患者中发现了外周血单核细胞和immature B细胞减少以及STAT1 GOF突变 (c.Y289C)的现象，进一步分析揭示了患者和健康对照组之间与免疫调节相关的差异表达基因。在这项研究中，作者采用单细胞转录组学分析，比常规临床试验更深入地了解CMC的病理机制，通过分析PBMCs的DEGs来探索潜在的相关基因，并更全面地阐述了具有STAT1 GOF突变的CMC患者的免疫反应。单细胞分析结果反映了患者在抗原提呈和抗菌作用方面的免疫缺陷。本研究的局限性在于CMC病例数量较少，未来需要加大样本量的研究来揭示患者之间的差异，此外，后续还可以通过细胞或动物实验对单细胞测序的结果进行验证。

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